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实验:DNA的细胞化学反应——Feulgen反应

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  一、实验目的:
  通过根尖压片法,掌握Feulgen反应显示DNA的基本原理和主要操作环节
  二、实验原理:
  Feulgen反应是1924年由Feulgen和Rossenbeck开创的。这一反应的原理是:DNA在一定的温度(60℃)下,被酸水解,打开嘌呤碱与脱氧核糖连接的键。在脱氧核糖的一端形成游离的醛基,醛基与Schiff试剂(脱色碱性品红)结合,形成紫红色化合物。所以,凡有DNA的部位,会呈现紫红色阳性反应,可以作为定性研究DNA的一种简便方法。
  三、实验用品:
  (一)、药品:
  1、Schiff试剂:称1g碱性品红,溶于200ml已煮沸的蒸馏水中(要漫漫加入,不可一下全部倒入),继续煮沸5分钟(搅动),然后使其冷却至50℃,过滤于棕色磨口瓶中,加入20ml1N HCl(取比重为1•19的HCl 32•5ml,加蒸馏水至1000ml即成),继续冷却至25℃时加入1g偏亚硫酸钾(KHSO3)或偏亚硫酸钠(NaHSO3),将瓶塞盖严,置于暗处24小时,溶液应为无色,可保持在1-4℃冰箱中备用。如果红色不退可加入2g活性炭粉末,搅动数分钟后静置数小时,再过滤即可脱去红色。
  2、1N HCl:取82.5ml比重为1.19的盐酸加蒸馏水1000ml即成(应将盐酸缓缓加入水中)。
  3、45%醋酸
  4、亚硫酸水溶液:在200ml自来水中,加入10ml 10%的偏亚硫酸钠(或偏亚硫酸钾)溶液,或加入10ml 30%的偏重亚硫酸钠溶液,再加入1N HCl 10ml即成,盖紧瓶塞。此液要现配现用。
  5、Carnoy固定液:95%酒精3份,冰醋酸1份混合即可。
  6、50%酒精、30%酒精。
  7、5%三氯醋酸
  (二)、用具:
  显微镜、恒温水浴锅、镊子、刀片、载玻片、盖玻片、酒精灯、青霉素小瓶、吸水纸等
  四、实验材料:
  大蒜、洋葱或蚕豆根尖
  五、方法步骤:
  1、取0•5-1cm的根尖,在carnoy固定液中固定2-24小时。固定时以冰箱中进行为宜。
  2、取出固定材料,用50%酒精、30%酒精、蒸馏水各冲洗5分钟,以除掉材料上的醋酸。准备两张切片,其中一张作对照。
  3、水解:用1N的冷HCl过洗材料一次,然后放入温度稳定在60℃的1N HCl中,水解10-14分钟,取出材料后再用1N冷HCl过一次。
  4、染色:将水解后的材料放入Schiff试剂中染色1小时左右,此时根尖部分会出现紫红色。
  5、用亚硫酸水漂洗三次,每次5分钟,使细胞质的紫红色退掉,再流水冲洗5—15分钟,洗后的材料放入蒸馏水中。
  8、用45%的醋酸压片。
  9、镜检。与对照装片比较。
  10、对照切片的制做:进行Feulgen反应时, 一般要做一对照切片以便验证反应结果。对照切片可用下面两种方法制作:○1不经水解直接放入schiff试剂内染色。○2 材料固定后用5%三氯醋酸于90℃处理15min,用蒸馏水冲洗,以后步骤同实验组。
  六、注意事项:
  1、Feulgen反应的染色深浅与材料、水解时的温度和时间都有关系。水解时间的长短要根据固定液和材料来进行选择,时间太短则游离的醛基量少而染色不深,时间太长会因醛基进一步变成其它物质,染色也不深。水解时的温度要严格控制。
  2、未经水解的对照切片在schiff试剂中最多不要超过1 h (0.5 h即可),时间过长,试剂本身的酸性也会使DNA水解,从而出现假的正反应。
  3、Schiff试剂的作用 :Feulgen反应成功与否的一个非常关键的因素,就是schiff试剂的质量。有一大类试剂均称为碱性品红,它们实际上是由几种产品分别组成的。因此只能选用注明“DNA染色反应用”的碱性品红才行。此外,Schiff试剂的配制方法也可影响DNA的染色反应。
  七、作业:
  1、绘图表示Feulgen反应的染色结果, 并验交Feulgen反应的压片1张。
  2、总结Feulgen反应染色结果的影响因素。
  3、Feulgen反应的实验原理是什么?
  4、在稀盐酸水解后,为什么要用亚硫酸水洗片?
  
  

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