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实验:植物材料中DNA的提取

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  一、实验目的:
  通过本实验了解用氯仿-异戊醇提取DNA的方法及原理
  二、实验原理:
  细胞经过破碎后,加入适当介质配合离心以脱除各种杂质,再用乙醇沉淀,DNA便以纤维状沉淀析出。
  三、实验用品:
  1、药品:
  1)研磨缓冲液[含0.45M NaCl, 0.045M柠檬酸三钠,0.1M EDTA, 1%SDS(十二烷基硫酸钠)PH7.0]
  2)5M高氯酸钠溶液
  3)氯仿
  4)异戊醇
  5)95%预冷乙醇
  6)0.1xSSC溶液(0.015M氯化钠,0.0015M柠檬酸三钠,PH7.0)
  7)10xSSC溶液(1.5M氯化钠,0.15M柠檬酸三钠,PH7.0)
  8)RNA酶溶液:RNA酶在0.15M绿化钠溶液(PH5.0)中溶解,并在80oC水浴中保温10分钟,以灭活可能染的DNA酶.然后冷却,在低温下保存备用.
  2、用具:
  1)磨口三角瓶
  2)离心机
  3)细口吸管、烧杯、量筒等
  4)恒温水浴锅
  5)研钵
  四、实验材料:  
  韭菜、玉米幼苗或豌豆幼苗
  五、方法步骤:
  1、将材料洗净吸干,称取20g,剪碎后放入研钵,加入30ml研磨缓冲液,然后剧烈研磨,使之成为浆状物
  2、将浆状物倒人磨口三角瓶内,加等体积的氯仿-异戊醇(24:1v/v)混合液,加上瓶塞,剧烈摇晃30秒钟,以脱除组织蛋白质
  3、在室温下离心(4000rpm)5分钟,这时混合物会形成三层,用细口吸管小心地吸取上层含有核酸的水溶液,弃去中间的细胞碎片、变性蛋白质及下层的氯仿
  4、将收集的水溶液倒入一个在70oC水浴中预热的三角瓶中,并在70oC下继续保温3-4分钟(不要超过4分钟),以灭活组织内DNA酶,然后讯速取出三角瓶,放在冰水浴中冷却到室温
  5、加入5M高氯酸钠溶液(4:1v/v),使溶液中高氯酸钠的最终浓度为1M
  6、再次加入等体积的氯仿-异戊醇(24:1v/v)混合液,并在带塞的三角瓶内摇晃30秒钟。
  7、将此乳浊液在室温下离心(4000rpm)5分钟后,收集上层含核酸的水溶液。
  8、将收集的水溶液置于烧杯内,然后用滴管慢慢地加入二倍体积的95%预冷过的乙醇于水溶液表面上,用玻璃棒轻轻搅动,此时核酸将讯速以纤维状沉淀缠绕在玻璃棒上。
  9、将核酸沉淀物在烧杯壁上轻轻挤压以除去乙醇,然后溶解在适量的0•1×SSC溶液中。待完全溶解后,加入此溶液十分之一体积的10×SSC溶液,使之最终成为1×SSC溶液。
  10、按照(8)的步骤,再次用乙醇沉淀核酸,并按照(9)的步骤将核酸溶解,即得DNA粗制品。
  11、加入RNA酶溶液使其最后作用的浓度为50-75ug/ml,并在37℃保温30分钟,以除去RNA。
  12、加入等体积的氯仿-异戊醇溶液(24:1v/v),在三角瓶内摇晃30秒,再次除去残留蛋白质及所加的RNA酶。然后,按照(7)的方法离心并收集上层水溶液。
  13、按照(8)再次沉淀DNA,并按照(9)的步骤将其溶解,即可得到纯化的DNA溶液。
  六、注意事项:
  1、水浴保温时,三角瓶不要加盖,否则加热过程中可能将瓶盖冲出
  2、用玻棒搅动时宜慢不宜快,否则DNA会断裂
  七、作业:
  1、实验中加入氯仿-异戊醇起什么作用?
  2、实验中加入高氯酸钠溶液又起什么作用?
  

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