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实验:口腔上皮细胞的荧光观察

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  一、实验目的:
  1、初步了解荧光显微镜的基本组件、位置和基本光路。
  2、初步掌握荧光显微镜的基本调节步骤。
  3、通过在荧光显微镜下观察口腔上皮细胞的细胞核和线粒体,了解荧光探针与细胞成分的结合特性和光谱特性。
  二、实验原理:
  本实验用的2种活细胞荧光探针分别为Hoechst 33342(Ho.33342)和罗丹明123(Rho-damine 123)。
  Hoechst 33342(Ho.33342)是双苯并咪唑类的一种衍生物,是一种亲脂性物质,能跨膜进入活细胞,在低浓度下毒性较弱.是一种能与DNA特异性结合的荧光探针,该探针的特点是既能与死细胞又能与活细胞的DNA特异性结合,因此被大量地应用于活细胞观察与定量的科学研究工作中。它的激发光波长约350nm,发射光波长约461nm。
  罗丹明123是一种亲脂性阳离子荧光探针,也能穿过活细胞的膜。实验证实,罗丹明123被线粒体吸收与电性吸引有关。线粒体内膜本身因富含负电性的糖蛋白而带负电荷,内膜外有大量质子积累造成外正内负的跨膜电位差。而罗丹明123具有正电荷,由于电性相吸,特异地标记上线粒体。它的激发光波长约507nm,发射光波长约为529nm。可用蓝光激发,被标记的线粒体发出绿色荧光。
  三、实验用品:
1、     药品:含5-10ug/ml Ho.33342的PBS(pH7·4);含10ug/ml 罗丹明 123的PBS(pH7·4)
2、     仪器和用具:
  荧光显微镜、温箱、载玻片、盖玻片、牙签、滤纸条、镊子、滴管等
  四、实验材料:
  口腔黏膜上皮细胞
  五、方法步骤:
  1、 用牙签刮取口腔上皮黏膜细胞,分别涂于2张载玻片上。
  2、2张载玻片的涂细胞处分别滴加Ho33342染液和罗丹明染液各一滴,在37℃暗处孵育20-30min。
  3、加盖玻片(注意防止气泡),用滤纸条吸掉盖玻片周围多余的水分。
  4、荧光观察细胞核:先关闭激发光,将滴加Ho33342染液的装片至于透射光下,找到样品焦面,再关闭透射光,置于激发光为紫外光(UV)、发射兰色荧光的滤片组合块下观察细胞核。先用10×荧光物镜观察,再换用40×荧光物镜观察。
  5、荧光观察线粒体:先关闭紫外激发光,将滴加罗丹明123的载玻片置于透射光下,找到样品焦面,再关闭透射光,置于激发光为兰光、发射绿色荧光的滤片组合块下观察线粒体。先用10×荧光物镜观察,再换用40×荧光物镜观察。
  六、注意事项:
  1.盖片时防止产生气泡
  2.滴加的染料不宜太多,否则背景太深,影响观察
  3.注意避光,包括制片、荧光观察和探针保存
  4.荧光探针都有一定的毒性,操作时防止污染皮肤和环境
  七、作业:
  根据观察实验结果,填表
  
 
细胞核
线粒体
荧光探针
 
 
激发光
 
 
发射光
 
 
形态(画出)
 
 
 
 

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