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实验:线粒体和液泡系的超活染色与观察

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  一、实验目的:
  1、观察动、植物活细胞内线粒体、液泡系的形态、数量与分布。
  2、学习一些细胞器的超活染色技术。
  二、实验原理:
  活体染色是指对生活有机体的细胞或组织能着色但又无毒害的一种染色方法。它的目的是显示生活细胞内的某些结构,而不影响细胞的生命活动和产生任何物理、化学变化以致引起细胞的死亡。活染技术可用来研究生活状态下的细胞形态结构和生理、病理状态。
  根据所用染色剂的性质和染色方法的不同,通常把活体染色分为体内活染与体外活染两类。体内活染是以胶体状的染料溶液注入动、植物体内,染料的胶粒固定、堆积在细胞内某些特殊结构里,达到易于识别的目的。体外活染又称超活染色,它是由活的动、植物分离出部分细胞或组织小块,以染料溶液浸染,染料被选择固定在活细胞的某种结构上而显色。
  活体染料之所以能固定、堆积在细胞内某些特殊的部位,主要是染料的“电化学”特性起重要作用。碱性染料的胶粒表面带阳离子,酸性染料的胶粒表面带阴离子,而被染的部分本身也是具有阴离子或阳离子的,这样,它们彼此之间就发生了吸引作用。但不是任何染料皆可以作为活体染色剂之用,应选择那些对细胞无毒性或毒性极小的染料,而且总是要配成稀淡的溶液来使用。一般是以碱性染料最为适用,可能因为它们具有溶解在类脂质(如卵磷脂、胆固醇等)的特性,易于被细胞吸收。詹纳斯绿B(Janus green B)和中性红(neutral red)两种碱性染料是活体染色剂中最重要的染料,对于线粒体和液泡系的染色各有专一性。
  三、实验用品:
  1、器材:显微镜、恒温水浴锅、载玻片、盖玻片、10ml量筒、吸管、牙签、吸水纸(或卫生纸)等。
  2、试剂:
  1)Ringer溶液(装入滴瓶)
  氯化钠   0•85g(变温动物用0•65g)
  氯化钾   0•25g
  氯化钙   0•03g
  蒸馏水   100ml
  2)1%、1/3000中性红溶液(装入棕色滴瓶)
  称取0•5g中性红溶于50mlRinger液,稍加热(30-40℃)使之很快溶解,用滤纸过滤,装于棕色瓶于暗处保存,否则易氧化沉淀,失去染色能力。
  临用前,取已配制的1%中性红溶液1ml,加入29mlRinger溶液混匀,装入棕色瓶备用。
  3)1%、1/5000詹纳斯绿B溶液(装入棕色滴瓶)
   称取50mg詹纳斯绿B溶于5mlRinger溶液中,稍加热(30-40℃),使之溶解,用滤纸过滤后,即为1%原液。取1%原液1ml加入49mlRinger溶液,即成1/5000工作液,装入瓶中备用。最好现用现配,以保持它的充分氧化能力。
  四、实验材料:
  1、人口腔上皮细胞
  2、洋葱鳞茎内表皮细胞
  3、小麦或黄豆幼根根尖
  五、方法步骤:
  (一)、线粒体的超活染色与观察:
  线粒体是细胞进行呼吸作用的场所,其形态和数量随不同物种、不同组织器官和不同的生理状态而发生变化。
  詹纳斯绿B是毒性较小的碱性染料,可专一性地对线粒体进行超活染色,这是由于线粒体内的细胞色素氧化酶系的作用,使染料始终保持氧化状态(即有色状态),呈蓝绿色;而线粒体周围的细胞质中,这些染料被还原为无色的色基(即无色状态)。
  1、人口腔黏膜上皮细胞线粒体的超活染色观察
  1)、取清洁载玻片放在37℃恒温水浴锅的金属板上,滴两滴1/5000詹纳斯绿B染液。
  2)、实验者用牙签宽头在自己口腔颊黏膜处稍用力刮取上皮细胞,将刮下的黏液状物放入载玻片的染液滴中,染色10——15分钟(注意不可使染液干燥,必要时可再加滴染液),盖上盖玻片,用吸水纸吸去四周溢出的染液,置显微镜下观察。
  3)、在低倍镜下,选择平展的口腔上皮细胞,换高倍镜或油镜进行观察。可见扁平状上皮细胞的核周围胞质中,分布着一些被染成蓝绿色的颗粒状或短棒状的结构,即是线粒体。
  2、洋葱鳞茎表皮细胞线粒体的超活染色观察
  1)用吸管吸取1/5000詹纳斯绿B染液,滴一滴于干净的载玻片上,然后,撕取一小片洋葱鳞茎内表皮,置于染液中,染色10—15分钟。
  2)用吸管吸去染液,加一滴Ringer液,注意使内表皮组织展平,盖上盖玻片进行观察。
  3)在高倍镜下,可见洋葱表皮细胞中央被一大液泡所占据,细胞核被挤至一侧贴细胞壁处。仔细观察细胞质中线粒体的形态与分布。
  (二)、液泡系的超活染色与观察
  中性红为弱减性染料,对液泡系的染色有专一性,只将活细胞中的液泡系染成红色,细胞核与细胞质完全不着色,这可能与液泡中某些蛋白质有关。
  1、 小麦或黄豆根尖细胞液泡系的中性红染色与观察
  1)实验前,将小麦或黄豆种子培养在培养皿内潮湿的滤纸上,使其发芽,胚根伸长到1cm以上。
  2)取初生的小麦或黄豆幼苗根尖(约1—2cm长),置于载波片上,滴一滴Ringer液,用镊子或刀片小心将根尖压成一薄片,吸去Ringer液,在材料上滴一滴1/3000中性红染液,染色5—10分钟。
  3)吸去染液,滴一滴Ringer液,盖上盖玻片,并用镊子轻轻地下压盖玻片,使根尖压扁,利于观察。
  4)在高倍镜下,先观察根尖部分的生长点的细胞,可见细胞质中散在很多大小不等的染成玫瑰红色的圆形小泡,这是初生的幼小液泡。然后,由生长点向延长区观察,在一些已分化长大的细胞内,液泡的染色较浅,体积增大,数目变少。在成熟区细胞中,一般只有一个淡红色的巨大液泡,占据细胞的绝大部分,将细胞核挤到细胞一侧贴近细胞壁处。
  2、洋葱表皮细胞液泡系的活体染色与观察:
  1)撕取洋葱鳞茎内表皮
  2)置于加有一滴1/3000的中性红染液的载玻片中,染色5—10分钟
  3)用吸水纸吸去染液,换上Ringer液,盖上盖玻片
  4)显微镜下观察,可见被染成砖红色的中央大液泡
   六、注意事项:
   1、在对口腔上皮细胞进行染色时不可使染液干燥,可适当补加染液。
  2、在对植物进行观察时一定要让材料尽量展开。
  七、作业:
  1、绘口腔上皮细胞示线粒体形态与分布
  2、绘小麦或黄豆根尖细胞示液泡系形态与分布
  

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