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实验:光镜下植物细胞骨架

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  一、实验目的:
  初步掌握在光镜下植物细胞骨架标本的制作方法。
  二、实验原理:
  用适当浓度的Tritonx-100处理植物细胞时,可将细胞内的蛋白质破坏,但却可以保留细胞骨架系统的蛋白质。后者用考马斯亮蓝染色,在光镜下可观察到细胞骨架的网状结构。
  三、实验用品:
  (一)药品
  1、M缓冲液:50mM咪唑,0•5mM氯化镁,1mM EGTA[乙二醇双(a-氨基乙苯)醚四乙酸],0•1mMEDTA(乙二胺四乙酸),1mM DTT(二硫苏糖醇)
  2、6mM PH6•5磷酸缓冲液(内含5mM KCl)
  3、1%Tritonx-100(用1液配制)
  4、3%戊二醛
  5、0•2%考马斯亮兰R250,用少许无水酒精溶解,然后用12•5%三氯醋酸定溶,装入滴瓶备用。
  (二)用具:50ml烧杯、剪刀、镊子、手术刀、玻璃滴管、称量瓶(或青霉素小瓶)、显微镜、载玻片、盖玻片、吸水纸(或卫生纸)、温箱等。
  四、实验材料:
  新鲜、幼嫩的洋葱鳞茎内表皮
  五、方法步骤:
  1、用镊子撕取洋葱鳞茎的内表皮(取材时注意不要用靠近边缘的内表皮),剪成0•5-1cm大小,放入10ml,6mM,PH6•5的磷酸缓冲液中。
  2、将材料取出,用1%Tritonx-100处理0•5-1小时,(28oC温箱),然后用M缓冲液洗3-5次,每次5分钟。
  3、用3%戊二醛固定一小时(28oC温箱)。
  4、用6mM,PH6•5的磷酸缓冲液洗3-5次,每次10分钟。
  5、用0•2%考马斯亮兰R250染色15min-0.5h(在载玻片上进行)。
  6、材料染色后用蒸馏水冲洗。
  7、制片,在高倍镜或油镜下观察,可见到与核联系的细胞骨架及靠近细胞壁的网状结构。
  六、注意事项:
  1、用Tritonx-100处理时,材料应浸泡入溶液
  2、染色时注意勿稀释药液
  七、作业:
  绘制洋葱鳞茎内表皮细胞的细胞骨架图。
  

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